Re: Fwd: Protocolo usado nos Exps RNA-Seq Leishmania A-Paraddise Murilo Sena Amaral 17 de janeiro de 2017 19:03 Para: Joice de Melo Agripino Cc: Juliana Fietto , Luciana Ângelo , Sergio Verjovski-Almeida , David da Silva Pires ok obrigado pelo envio das concentrações das drogas usadas. Estas informações serão importantes para correta identificação das amostras no pipeline de análises. Murilo Em 17 de janeiro de 2017 18:39, Joice de Melo Agripino escreveu: Boa tarde, As concentrações de compostos utilizadas foram 1/4 do IC 50. BSF2: IC50 0,64 micromolar; TH85: IC 50 7,20 micromolar. Usamos 0,16 micromolar do BSF2 e 1,8 micromolar do TH85 na infecção. Joice de Melo Agripino Mensagem enviada por telefone. Desculpe eventuais erros de digitação. De: Juliana Fietto Enviado: segunda-feira, 16 de janeiro 16:52 Assunto: Fwd: Protocolo usado nos Exps RNA-Seq Leishmania A-Paraddise Para: Joice de Melo Cc: Luciana Ângelo Joice e Luciana Por favor vejam qual a concentração das drogas usadas nos ensaios de trasncriptoma e respondam para o Murilo conforme mensagem abaixo. Obrigado Juliana Profa. Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular-DBB Universidade Federal de Viçosa-UFV Minas Gerais-Brasil telefones: 31 38993042 ou 31 38992374 (fone,fax) e-mail intitucional: jufietto@ufv.br Dr. Juliana Lopes Rangel Fietto Biochemistry and Molecular Biology Department Universidade Federal de Viçosa Minas Gerais- Brazil +55 31 38993042 + 55 31 38992374 (phone-fax) ---------- Mensagem encaminhada ---------- De: Murilo Sena Amaral Data: 16 de janeiro de 2017 09:41 Assunto: Re: Protocolo usado nos Exps RNA-Seq Leishmania A-Paraddise Para: Juliana Fietto Cc: Sergio Verjovski-Almeida , Joice de Melo , Matheus Bastos Olá, apenas para relembrar do envio das concentrações das drogas, por favor. Obrigado, Murilo Em 9 de janeiro de 2017 12:30, Juliana Fietto escreveu: Murilo Estou em viagem de férias por isto só tenho como lhe responder sobre as concentrações quando eu voltar a vicosa depois do dia 15. Por favor me cobre novamente após esta data. Em 8 de jan de 2017 01:26, "Murilo Sena Amaral" escreveu: Olá Matheus, obrigado pelas informações. Quando possível, por favor enviem as concentrações das drogas que foram usadas. O sequenciamento ficará pronto até o final de janeiro. Quando tiver mais novidades, aviso. Murilo Em 7 de janeiro de 2017 08:52, Matheus Bastos escreveu: Bom dia Murilo, aqui está tudo ótimo e ai? Feliz 2017. Não estou mais em viçosa e meu caderno ficou no laboratório, mas vou tentar explicar com as informações que lembro de cabeça. Se precisar de algum detalhe que eu não lembre, teremos de pedir alguém para checar no caderno. Por favor inclua cepas da Leishmania (M2904/GFP) e macrófagos (RAW 264.7), meios, tamanhos das garrafas usadas, tempos de tratamento, concentração da drogas e todos os demais procedimentos do wet lab. Os macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram cultivadas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 em meio RPMI-1640 pH 7.2, suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (LGC Biotecnologia), 2mM de L-glutamina (Serva), 2 g/L de bicarbonato de sódio, 100 µg/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicinal (USB Corporation). Os parasitos foram cultivados a 25°C em meio Grace’s (Sigma-Aldrich), pH 6.5, suplementado com 10 % de soro fetal bovino inativado (LGC Biotecnologia), 2 mM de L-glutamina (Serva), 100 µg/mL de penicilina (USB Corporation). Após o descongelamento e recuperação das células, os repiques foram feitos com intervalos de 4-5 dias. Para ensaios de infecção, o cultivo foi estendido até o 7° dia de cultura para obtermos um maior número de promastigotas metacíclicas. Teste dos compostos nos macrófagos infectados por L. braziliensis GFP: inicialmente 10 milhões de macrófagos foram distribuídos em garrafa de cultura de 75 cm de área (têm que confirmar é uma garrava que de 75 mL). Estas células foram incubadas por 24 horas em estufa 37 °C, 5% de CO2. Após o tempo de incubação o meio foi removido e foi adicionado 10 mL de meio novo. Em seguida foi feito a infecção adicionando 200 milhões de leishmania GFP na garrafa. A garrafa foi incubada por mais 24 horas em estufa 37 °C, 5% de CO2 e posteriormente lavada 3 vezes com meio RPMI base. Após a lavagem foi adicionado novo meio RPMI suplementado e a garrafa foi incubada novamente nas mesmas condições, por mais 24 horas. Em seguida o meio da garrafa foi trocado novamente por RPMI suplementado e foi feita a adição dos compostos (1/4 do IC50, não lembro as concentrações de cabeça, acho naquela nossa tabela tem a informação). Após a adição das drogas as garrafas foram incubadas novamente por mais 48 horas em estufa 37 °C, 5% de CO2 (seguindo o mesmo protocolo usado para determinar o IC50). Após 48 horas de tratamento as células foram raspadas da garrafa e o rendimento da infecção foi determinado por microscopia de fluorescência. Em seguida as células foram centrifugadas e o pellet armazenado em trizol (o volume de trizol foi variou um pouco devido ao numero de células recuperado em cada experimento, sempre seguindo o manual do trizol, mas em geral foi usado 1 ml). Em seguida as amostras foram armazenadas em freezer -80ºC. Se tiver faltado algo é me avise, acho que coloquei tudo. As concentrações das drogas usadas realmente não lembro de cabeça, mas é fácil obter o valor com a Juliana. Vocês já obtiveram algum retorno do sequenciamento? Em 6 de janeiro de 2017 13:42, Murilo Sena Amaral escreveu: Olá Matheus, tudo bem? Feliz 2017! Apenas para meus arquivos, você poderia por favor enviar o protocolo detalhado que você usou para a infecção e tratamento nos ensaios de tratamento de Leishmania com TH85 e BSF2 para RNA-Seq do A-Paraddise? Por favor inclua cepas da Leishmania e macrófagos, meios, tamanhos das garrafas usadas, tempos de tratamento, concentração da drogas e todos os demais procedimentos do wet lab. Obrigado, Murilo -- Murilo Sena Amaral, PhD ______________________ Instituto Butantan Av. Vital Brasil 1500 Prédio 55 05503-900 Sao Paulo, SP Brasil fone: +55-11-2627-3855 e-mail: murilo.amaral@butantan.gov.br http://verjo2.iq.usp.br www.butantan.gov.br -- D.Sc. Matheus Silva e Bastos Postdoctoral Fellow Universidade Federal de Viçosa Pesquisador colaborador da Universidade Federal de Viçosa Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (DBB) Tel.: (031)3899-3717 -- Murilo Sena Amaral, PhD ______________________ Instituto Butantan Av. Vital Brasil 1500 Prédio 55 05503-900 Sao Paulo, SP Brasil fone: +55-11-2627-3855 e-mail: murilo.amaral@butantan.gov.br http://verjo2.iq.usp.br www.butantan.gov.br -- Murilo Sena Amaral, PhD ______________________ Instituto Butantan Av. Vital Brasil 1500 Prédio 55 05503-900 Sao Paulo, SP Brasil fone: +55-11-2627-3855 e-mail: murilo.amaral@butantan.gov.br http://verjo2.iq.usp.br www.butantan.gov.br --  Murilo Sena Amaral, PhD ______________________ Instituto Butantan Av. Vital Brasil 1500 Prédio 55 05503-900 Sao Paulo, SP Brasil fone: +55-11-2627-3855 e-mail: murilo.amaral@butantan.gov.br http://verjo2.iq.usp.br www.butantan.gov.br